А.Д. Аммосов. Клещевой энцефалит. Кольцово. 2002г.

Содержание

5. Молекулярно-генетическая неоднородность и патогенность вируса клещевого энцефалита

5.1. Генотипы и серотипы вируса

По результатам РТГА антигенные группы флавивирусов были разделены на 8 родственных комплексов или групп. Вне этих групп также к флавивирусам относится вирус желтой лихорадки. В первый из комплексов - антигенный комплекс вирусов клещевого энцефалита - входят: вирусы клещевого энцефалита, омской геморрагической лихорадки, кьясанурской лесной болезни, Louping ill (шотландского энцефаломиелита овец), Лангат, Повассан, Негиши, Карши и Royal Farm [41]. По результатам генотипирования штаммов ВКЭ штамм Вергина, считавшийся одним из штаммов ВКЭ, кластеризуется с вирусами комплекса клещевого энцефалита греческого и турецкого энцефаломиелита овец и, по-видимому, не является собственно вирусом клещевого энцефалита [78].

В ряде первых работ уровень гомологии и генетические взаимоотношения штаммов ВКЭ изучались методом генотипирования с применением двух типов зондов: кДНК-зонда, представляющего собой комплементарные копии трех фрагментов геномной РНК ВКЭ штамма Софьин в составе рекомбинантных плазмид, суммарно прекрывающих около половины вирусного генома со стороны 5’-конца, а также синтетических олигонуклеотидных ДНК-зондов длиной 18-26 нуклеотидов, комплементарных различным участкам РНК ВКЭ. Кроме того, использовали два олигонуклеотидных зонда, специфичных для западного штамма Найдорф. На основании способности РНК 143-х штаммов ВКЭ гибридизоваться с перечисленными зондами был разработан критерий отнесения каждого штамма вируса к одному из шести условно выделенных генетических вариантов вируса.

Генетическую вариабельность природных популяций ВКЭ изучали с помощью коллекции из 200 штаммов, изолированных из различных эндемичных районов бывшего Советского Союза - от Приморья на востоке до Западной Украины и Калининградской области на западе, Крыма и Киргизии на юге. Оказалось, что установленные методом молекулярной эпидемиологии с применением ДНК-зондов те или иные варианты вируса циркулируют на разных, иногда весьма отдаленных друг от друга территориях или имеют смешанные совместные места распространения. Было показано, что штаммы, подобные прототипному штамму Софьин дальневосточного подтипа, составляли всего 16 % изученной коллекции и встречались преимущественно на Дальнем Востоке, реже - в западной части обследованного ареала и совсем редко - в Сибири и на Урале. Также выявлено, что штаммы, обладающие некоторыми геномными последовательностями, характерными для европейского штамма Найдорф, распространены на восток, по крайней мере, до территории Западной Сибири [9-13, 24, 52].

В другой работе Злобин В.И. с соавторами для генотипирования ВКЭ получали кДНК-копии фрагмента гена Е длиной 160 нуклеотидов, используя ПЦР с необходимыми специфическими праймерами. Полученные фрагменты секвенировали и оценивали уровни гомологии. При различиях нуклеотидных последовательностей между двумя штаммами в 12% и более их относили к двум разным генотипам. Анализ гомологии фрагмента гена Е 35 штаммов ВКЭ, изолированных в различных участках ареала, показал, что они могут быть разделены также на 6 генотипов [56].

В опубликованных позже работах Xeinz с соавторами генотипирование ВКЭ было проведено анализом нуклеотидных последовательностей полного гена белка Е из 1488 нуклеотидов и полных аминокислотных последовательностей белка Е 25 штаммов ВКЭ, изолированных по всей территории распространения клещевого энцефалита в Европе и Азии [43]. Были синтезированы подходящие полимеразные праймеры для амплификации гена белка Е. Амплифицированные с применением ПЦР гены Е ВКЭ всех 25 штаммов были секвенированы. Список штаммов ВКЭ, изученных путем анализа первичной нуклеотидной последовательности гена и сопоставления нуклеотидной и соответствующей аминокислотной последовательностей белка Е каждого штамма, приводится в табл. 1. Данные по нуклеотидной последовательности гена Е части штаммов ВКЭ были взяты из опубликованных работ других авторов. Географическое местоположение каждого выделенного изолята ВКЭ на евразийском континенте указано на ранее представленной карте (рис. 1). В результате филогенетического анализа нуклеотидных и аминокислотных последовательностей вирусного белка Е авторами выявлены всего 3 генетические линии штаммов, соответствующие европейскому, дальневосточному и сибирскому субтипам ВКЭ. Филогенетическое древо происхождения вирусов трех субтипов ВКЭ иллюстрируется на рис. 6. Как установлено, степень вариации в составе аминокислотных остатков белка в пределах одного субтипа вируса незначительна и колеблется в пределах всего 2,2%. Максимальная степень расхождения в составе аминокислотных остатков белка Е между субтипами вируса достигает 5,6%, что находится в пределах колебаний этой характеристики, соответствующей разнице между различными флавивирусами. На этом основании считается оправданным выделение ВКЭ в качестве самостоятельного представителя флавивирусов с тремя субтипами: европейский субтип ВКЭ с прототипным штаммом Найдорф, включающий другие штаммы этого вируса из Австрии, Швейцарии, Франции, Германии, Венгрии, Чехии, Словении, Хорватии, Финляндии, Белоруссии и Европейской части России; дальневосточный субтип ВКЭ с прототипным дальневосточным штаммом Софьин, включающий другие штаммы этого вируса из Дальнего Востока, Китая, Японии и также некоторые штаммы ВКЭ из Латвии, Украины и западной части России; сибирский субтип ВКЭ с прототипным штаммом Айна, включающий штамм Васильченко и другие многочисленные восточно- и западносибирские штаммы вируса [45]. Как подчеркнуто авторами работы [43], у белка Е ВКЭ степень вариабельности аминокислотного состава (0-5,6%) значительно ниже величины вариации нуклеотидного состава (1-16,9%) в первичной последовательности его гена, и селекционный пресс эволюции вируса более однозначно фиксируется в аминокислотном составе белковой молекулы вируса. Поэтому в аминокислотной последовательности белковой молекулы легче могут быть выделены генотипически характеристические фрагменты последовательности остатков аминокислот. Например, в поз. 206 аминокислотной последовательности белка Е все три генотипа вируса представлены тремя различными неповторяющимися аминокислотными остатками, уникальными для каждого субтипа вируса: для европейского - Val, для сибирского - Leu и для дальневосточного субтипа ВКЭ - Ser. В результате, по мнению авторов [43], на основе идентификации аминокислотного остатка в поз. 206 и части других характеристических остатков белковой молекулы субтип каждого нового изолята ВКЭ из трех выявленных генотипов вируса в настоящее время может быть расшифрован не обязательно полным, а только частичным секвенированием ге-на Е, его фрагментов, соответствующих характерным участкам белка Е.

Согласно недавним публикациям Злобина В.И. с соавторами, эти З субтипа ВКЭ могут быть установлены также на основе анализа первичной структуры или уровней гомологии фрагмента гена белка Е [77, 78]. Генотипирование ВКЭ с получением аналогичных результатов может быть проведено и методом гибридизации нуклеиновых кислот с применением молекулярных зондов, составленных из олигонуклеотидов длиной 18-22 оснований, комплементарных фрагментам РНК, кодирующим белок Е прототипных штаммов ВКЭ [79]. При этом штаммы ВКЭ, отнесенные в выше цитированных ранних работах Злобина В.И. с соавторами к генотипам 4 и 5 на основании степени их отличий в гомологии нуклеотидных последовательностей от штаммов генотипа 1, 2 и 3, в результате сравнения выведенных соответствующих аминокислотных последовательностей фрагмента белка Е в новых работах этих авторов отнесены к генотипам 2 и 3. Штамм Вергина, ранее отнесенный генотипу 6, примыкает к вирусам турецкого энцефаломиелита овец, греческого энцефаломиелита коз и, по-видимому, является не вирусом клещевого энцефалита, а относится к вирусам антигенного комплекса клещевого энцефалита.

Насколько полно установленные в настоящее время три субтипа ВКЭ - европейский, дальневосточный и сибирский - представляют все разнообразие природных штаммов вируса, по-видимому, будет показано при дальнейшем изучении новых штаммов вируса. Изоляты вируса с новых мест и территорий, охватывающих более полно огромный ареал распространения вируса, будут отражать в своем геноме более адекватно все разнообразие условий циркуляции вируса в природе.

Филогенетическое древо, или родословная ВКЭ, построенное авторами работ [43, 46], исходя из последовательности полного гена вирусного белка Е, состоит из трех ветвей, что отражает существование трех репродуктивно изолированных субтипов вируса, первоначально происходящих от одного предшественника. Предполагается, что первичным ареалом становления ВКЭ являлся Дальний Восток России, и отсюда вирус эволюционировал и распространялся в северном полушарии Земли с востока на запад. Это заключение расходится с ранее выдвинутой гипотезой, согласно которой через восточноазиатское и индоазиатские миграционные русла на востоке и восточноевропейские - на западе на территории ареалов I. persulcatus и I. ricinus во время весенней миграции птиц систематически заносились вирусы, некоторые из которых могли адаптироваться к этим видам клещей. В результате дальнейшей эволюции из двух центров и могла сформироваться генетически устойчивая двухвидовая популяция ВКЭ [81].

Эволюция - процесс постепенный, непрерывный и очень длительный. Исходя из средней частоты нуклеотидных замещений в генах изученных штаммов вируса, изолированных в разное время, и зная синономические дистанции филогении нуклеотидных последовательностей вируса, удается оценить общее время становления флавивирусов из группы антигенного комплекса клещевого энцефалита. По этим данным ВКЭ эволюционирует в течение нескольких тысяч лет и достиг Западной Европы 1-2 тыс. лет назад. Дивергенция дальневосточного и сибирского субтипов вируса произошла 1700-2000 лет назад. А отдельный японский клещевой пул вируса на юге острова Хоккайдо со штаммом Oshima, по мнению авторов, происходит из Дальнего Востока и образует новый эндемичный район распространения клещевого энцефалита в течение последних 260-430 лет [46].

По данным этих работ средняя частота нуклеотидных замещений в структурных генах ВКЭ достаточно высока и равняется 2,90'10-4заменам на один сайт в течение года. Однако, она значительно ниже, чем у других распространенных РНК вирусов, например, ВИЧ и ВГС, где частота замещений составляет 1,310'10-2и 1,308'10-2замен на один нуклеотидный сайт в год, соответственно. Предполагается, что это как-то связано с двойной природой клеток хозяев-носителей и животных-прокормителей клещей у ВКЭ - членистоногих и позвоночных.

Территориальные антигенные серотипы ВКЭ и их известные, наиболее характерные прототипные штаммы на территории России и в Европе были ранее выявлены серологическими методами в течение длительного времени с учетом существенных антигенных отличий от известных серотипов, широты ареала, их роли в этиологии манифестных форм заболевания (острых, хронических) и влияния штаммов на формирование популяционного иммунитета. Считается, что на территории России к настоящему времени обнаружено пять антигенных вариантов (подтипов) ВКЭ: дальневосточный; западный (центрально-европейский); Вергина; восточносибирский; урало-сибирский. По мнению авторов [52], исходя из результатов разных работ, полученных с помощью различных методов и реагентов, включая моноклональные антитела, позволяющих фиксировать внутривидовые антигенные вариации ВКЭ, можно сделать вывод, что те или иные сероварианты вируса циркулируют на разных, иногда весьма удаленных друг от друга территориях или имеют совместные места обитания. В частности, показано, что штаммы, относящиеся к дальневосточному антигенному варианту, встречаются также в Восточной и Западной Сибири, на Урале и даже на самой западной российской территории - в Калининградской области. В то же время в Восточной и Западной Сибири обнаружены дальневосточный, восточносибирский и урало-сибирский варианты, на Урале - дальневосточный и урало-сибирский, в Центральном районе европейской России описано выделение штаммов, принадлежащих к вариантам Вергина и западному. Как подчеркивается авторами [52], по-видимому, очень сложно адекватно оценить и свести в единое целое результаты многочисленных работ, посвященных антигенной вариабельности ВКЭ, и тем более попытаться нарисовать картину географического распространения антигенных субтипов (серотипов) в пределах его ареала в силу разнородности методических подходов и оценочных критериев разных исследователей. Как представляется В.И. Злобину и О.З. Горину, для характеристики генетической вариабельности вируса больше подходит сравнение уровней гомологии геномов различных изолятов. Очевидно, это так, однако, как видно из изложенного выше, разночтения вначале были возможны и в установлении генотипов вируса методами секвенирования гена белка Е ВКЭ или молекулярной гибридизации фрагментов кДНК с РНК ВКЭ.

Исторически получилось так, что лабораторная идентификация антигенной неоднородности, и тем самым соответствующей генетической гетерогенности штаммов ВКЭ, проводилась серологическими методами наравне с изучением клинических проявлений клещевого энцефалита в регионах. Например, штамм Айна/1448 (Айна) восточносибирского антигенного подтипа ВКЭ впервые был выделен в 1963 г. из ликвора больной клещевым энцефалитом 11-летней девочки по имени Айна, жительницы лесостепной зоны Иркутской области. Предполагался алиментарный путь заражения через сырое коровье молоко. Заболевание началось внезапно с головной боли с температурой 39°С и с носовым кровотечением. Через 3 недели развился парез правой руки и ноги. Позже в клинике нервных болезней г. Иркутска диагностирована кожевниковская эпилепсия. На 131-й день болезни в крови больной выявлены антитела к аутоштамму при отрицательной реакции с антителами к ВКЭ штамма Софьин. Последующее изучение антигенной структуры штамма Айна с использованием методов РДПА и принципа перекрестной дозированной адсорбции сывороток позволило выявить серологическое отличие этого штамма вируса не только от штамма Софьин дальневосточного, но и от штамма Найдорф западного серотипа ВКЭ и оценить его как самостоятельный сибирский (восточносибирский) серотип ВКЭ [14].

Установлено, что сибирский серотип ВКЭ с прототипным штаммом Айна включает многочисленные близкородственные штаммы этого вируса, выделенные из различных источников на территории Иркутской, Читинской, Курганской и других областей, Красноярского и Приморского краев, республики Бурятия. Из 47 изученных иркутских штаммов 31 штамм включен в серотип ВКЭ с прототипным штаммом Айна; они составляют однотипную по антигенным свойствам группу с небольшими количественными вариациями. Из них 7 штаммов выделены из мозга грызунов; 15 штаммов - из клещей I. persulcatus, по одному штамму - из клещей D. nuttalli и из мозга утки-широконоски, 5 штаммов - от больных хроническими формами клещевого энцефалита и другими хроническими заболеваниями ЦНС, один штамм - из мозга человека, погибшего при остром клещевом энцефалите.

Связь вируса этого серотипа с этиологией острых и хронических форм клещевого энцефалита подтверждена многими клиническими иммунологическими работами. В группе больных клещевым энцефалитом из Иркутской области сыворотки, избирательно реагирующие только со штаммом Айна, выявляются достоверно чаще (36,8%), чем в целом в популяции (16,6%) [14]. При обследовании больного хроническим клещевым энцефалитом из Красноярского края через 4 и 5 лет от начала заболевания выявлены антигемагглютинины только к штамму Айна в титре 1:20-1:40 при отрицательных результатах реакции с антигенами штаммов 256 (западный штамм, выделенный в Белоруссии) и Софьин. С терапевтическими целями больному была введена инактивированная вакцина клещевого энцефалита из штамма Софьин. Вторичный иммунный ответ характеризовался появлением антигемагглютининов к восточному и к западному серотипам ВКЭ при одновременном резком подъеме титра антител к штамму Айна до 1:320. Данный пример наглядно показывает, что штамм серотипа Айна причастен к этиологии хронического клещевого энцефалита у этого больного, антигены восточного, сибирского и западного серотипов ВКЭ отличаются серологически. Однако, при введении вакцины лицу, имеющему грундиммунитет, индуцированный инфекцией клещевого энцефалита штаммом-возбудителем серотипа Айна, вторичный иммунный ответ имеет более широкий поликлональный, полиштаммовый характер.

В структуре иммунитета к серотипам ВКЭ у здорового серопозитивного населения ряда сибирских регионов вируснейтрализующие антитела к штаммам Айна+Софьин, только к штамму Айнлещей. Р’ результате дальнейшей эволюции РёР· РґРІСѓС… центров Рё могла сформироваться генетически устойчивая двухвидовая популяция Р’РљР­ [81].

Эволюция - процесс постепенный, непрерывный Рё очень длительный. Р