А.Д. Аммосов. Клещевой энцефалит. Кольцово. 2002г.

Содержание

4. Молекулярная биология вируса клещевого энцефалита

4.1. Морфология и структурно-функциональные характеристики флавивирусов

Возбудитель острого и хронического клещевого энцефалита - ВКЭ - как и вирионы всех флавивирусов, имеет сферическую форму диаметром до 50-60 нм, покрытую гликопротеиновой оболочкой. Внутри внешней оболочки размещается вирусный капсид - геномный нуклеопротеиновый комплекс, покрытый коровым белком диаметром около 30 нм. В своем составе вирусная частица содержит 68% белка, 8% РНК, 17% липидов и 9% углеводов.

Неионные детергенты, такие, как тритон-Х, солюбилизируют оболочку вируса, удаляя все белки оболочки; дезоксихолат натрия снимает только бислойную мембрану внешней оболочки, оставляя коровый белок ассоциированным с нуклеокапсидом вируса. Обработка протеазами выявляет, что якорная часть гликопротеина оболочки вируса утоплена в липидном бислое. Оболочка флавивирусов защищает геном вируса от внутриклеточных протеаз, а раздетый нуклеокапсид деградируется рибонклеазами. Во внешней среде в составе мозговой суспензии на физиологическом растворе полностью собранная частица ВКЭ сохраняет жизнеспособность при комнатной температуре до 10 дней. Вирус устойчив в кислой среде, в частности, в составе желудочного сока; вирус в крови или его суспензия в белковом растворе инактивируются при 56°С в течение 30 мин. Кипячение убивает вирус в течение 2-3 мин. В глубоко замороженном виде или лиофилизированном состоянии в вакууме вирус сохраняет жизнеспособность многие годы. Благодаря бислойной липидной природе оболочки вирус чувствителен к эфиру, растворам лизола, спиртам.

Геном флавивирусов в составе нуклеокапсида представлен одной молекулой однонитчатой РНК положительной полярности общей длиной около 11 тыс. нуклеотидов, которые кодируют полипептидную цепь длиной 3,4-3,6 тыс. аминокислотных остатков (а.о.). Вирусная РНК cодержит 7-метилгуанозиновый кэп на 5’-конце. Геномная РНК служит в качестве мРНК для внутриклеточного синтеза вирусных белков. Для сборки зрелого флавивируса синтезируются 3 вирусных структурных белка: капсидный белок С, мембранный белок М и поверхностный белок Е. Незрелые внутриклеточные вирусные частицы содержат гликозилированный белок-предшественник рreM. Кроме того, в геноме флавивирусов закодированы неструктурные белки NS1-NS5, вирусная РНК-полимераза, которые обнаружены в инфицированной клетке и участвуют в репликации вируса. В геноме все белки закодированы последовательно в виде одной открытой рамки считывания. Индивидуальные белки вируса образуются в результате ко- или посттрансляционного расщепления единого вирусного полипротеина-предшественника протеазами вирусного или клеточного происхождения.

В репликативном цикле геномная РНК является инициатором инфекционного процесса и служит матрицей для создания дочерних копий.

4.2. Организация генома ВКЭ и экспрессия структурных и неструктурных вирусных белков

Нуклеотидная последовательность всего генома ВКЭ и полная аминокислотная последовательность полипротеина вируса расшифрованы Плетневым с соавторами [19]. На рис. 2 представлена линейная генетическая карта вируса с указанием кодируемых генов всех структурных и неструктурных белков и концевых нетранслируемых областей генома ВКЭ штамма Софьин. Этот штамм вируса выделен от больного на Дальнем Востоке еще в 1937 г., прошел несколько десятков пассажей на лабораторных животных и пермиссивных клетках. Широко известен как прототипный штамм регионального дальневосточного генетического субтипа или антигенного серотипа ВКЭ.

Немного позже были расшифрованы полная нуклеотидная последовательность генома ВКЭ западного штамма Neudoerfl (Найдорф) [25], дальневосточного штамма 205 [30] и другого вируса из антигенного комплекса ВКЭ - вируса Повассан [73].

Длина одноцепочечной РНК генома ВКЭ штамма Софьин составляет 10477 нуклеотидов. Последовательность нуклеотидов содержит единственную открытую рамку считывания белка (поз. 127-10363), кодирующую 3412 а.о. полипротеина. С 5’-конца генома 126 нуклеотидов предшествуют инициирующему транскрипцию кодону AUG; затем следует открытая рамка считывания полипротеина-предшественника всех структурных и неструктурных белков вируса длиной 10236 нуклеотидов. В другом конце полинуклеотидной последовательности геномной РНК представлены UAA-стоп кодон и 112 нуклеотидов её 3’-нетранслируемой области.

Первым с N-концевой части полипротеина ВКЭ находится нуклеокапсидный кор-белок С, состоящий из 111 а.о. Молекулярная масса белка С равна 12108 Da. При сборке вируса он вместе с геномной РНК образуют центральную структурную компоненту нуклеокапсида. Коровый белок обогащен остатками основных аминокислот: доля остатков аргинина и лизина, по-видимому, необходимых для нейтрализации зарядов на РНК при ее упаковке в нуклеокапсид, составляет 21,4%. Следующим от N-конца фрагментом полипротеина, выщепляемым протеазами, является гликопротеин preM-полипептид длиной 168 а.о. PreM является только предшественником в синтезе вирионного белка М, его нет в составе зрелого вириона в крови, не удается обнаружить его и в зараженных вирусом клетках. Мембранный белок М, содержащийся в составе оболочки зрелого вируса, представлен 75 остатками аминокислот, имеет молекулярную массу 8209 Da. В С-концевой части белка находятся два гидрофобных участка, разделенных остатком аргинина. Подобные последовательности имеются в белках М всех представителей флавивирусов. По-видимому, они обеспечивают этим белкам трансмембранную локализацию и важны для посттрансляционной модификации.

Следующим отщепляемым от предшественника полипептидом является наиболее важный поверхностный вирионный белок Е. Полипептидная цепь белка Е, включающая 496 а.о. с молекулярной массой 53680 Da, заканчивается двумя гидрофобными участками, вероятно, служащими трансмембранным «якорем» белка. Белок Е слабоосновный, так как 47 остатков аспарагина и глутаминовой кислоты приходятся на 50 остатков основных аминокислот. Считается, что процессинг полипротеина между белком Е и неструктурным белком NS1 осуществляет связанная с мембранами аппарата Гольджи протеиназа. Структура сайта протеолиза между этими белками высококонсервативна у всех флавивирусов. С учетом вклада гликозилирования (2 % от массы белка) молекулярная масса гликопротеина Е составляет 55000 Da. В вирионном белке Е гликозилирование происходит только по одному месту (поз.154 а.о.) полипептидной цепи. Нуклеотидная последовательность генов структурных белков ряда флавивирусов была опубликована ранее [20, 21].

Расщепление полипротеинов флавивирусов протеиназой со специфичностью к последовательности Val-X-Ala, расположенной на расстоянии (-3)-(-1) от места гидролиза, обеспечивает формирование N-концов белков NS2A и NS4B. По мнению авторов [19], кроме такого типа протеолиза полипротеинов флавивирусов формирование N-концевых последовательностей белков NS3, NS4A и NS5 осуществляет, по-видимому, вирусспецифическая протеиназа по последовательности, обогащенной остатками основных аминокислот, которым предшествуют протяженные гидрофобные участки полипротеинов. Функцию вирусспецифической протеиназы могут, вероятно, выполнять белки preM или NS1, так как в их составе присутствуют последовательности Cys-Trp, часто встречающиеся в активных центрах тиоловых протеиназ. Учет этих двух типов гидролиза полипротеинов флавивирусов приводит к локализации семи неструктурных белковых продуктов (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B и NS5), наблюдаемых в инфицированных флавивирусами клетках, в том числе и при репликации ВКЭ.

Низкомолекулярные белки NS2A, NS2B, NS4A и NS4B с М 24873, 14531, 16063 и 27585 Da, соответственно, - это гидрофобные белки с протяженными участками остатков незаряженных аминокислот. Функции этих молекул в развитии вируса в клетках только выясняются. Более высокомолекулярные белки NS1, NS3 и NS5 легко обнаруживаются в инфицированных флавивирусами клетках, в сыворотке крови или спинномозговой жидкости больных клещевым энцефалитом.

Нестуктурный белок NS1 (M 39162 Da) является гликопротеином и обладает иммуногенными свойствами. Комплекс белка NS1 с гликопротеином Е отсутствует в зараженных клетках, несмотря на накопление индивидуальных составляющих его субъединиц, только секретируется в сыворотку крови [76]. Внеклеточная локализация комплекса на поздних стадиях инфекции исключает его участие в созревании вирионов и создает оптимальные условия для индукции синтеза вирусспецифических антител. Эти антитела способны вызвать комплемент-зависимый лизис инфицированных вирусом клеток. С другой стороны, фрагменты белка NS1 экспонируются на поверхности инфицированных ВКЭ клеток и индуцируют эффекторные CTL клеточного иммунитета. Предварительная иммунизация животных белком NS1 ВКЭ, вирусов лихорадки Денге и желтой лихорадки приводит к защите животных от высоких доз заражения этими вирусами. Однако, в сыворотке крови животных, иммунизированных NS1 ВКЭ, не обнаруживают вируснейтрализующих антител. Известно, что мутации в NS1 влияют на вирулентность флавивирусов. Предполагается, что NS1 также воздействует на ранние процессы репликации. В инфицированной клетке этот белок обнаруживается в димерной форме, либо во фракции белка с М 49000 Da. Последняя, по-видимому, представляет собой слитую форму NS1-NS2A, которая за счет гидрофобности цепи NS2A приобретает способность удерживаться на клеточных мембранах.

Второй крупный неструктурный белок NS3 (68949 Da), возможно, обладает протеазной, геликазной и рибо-НTФ-азной активностями. В составе третьего крупного неструктурного белка NS5 (102639 Da) всех флавивирусов присутствует последовательность, характерная для РНК-зависимых РНК-полимераз вирусов животных и растений: Gly-Asp-Asp. Белки NS3 и NS5, по-видимому, необходимы для репликации вирусной РНК, так как в зараженных клетках они находятся в околоядерной области в составе комплекса с репликативной формой вирусного генома. Ассоциация комплекса с мембранами эндоплазматического ретикулума хозяйских клеток исключает возможность контактов с системой иммунитета и обеспечивает репродукцию ВКЭ в организме. Изменение соотношения составляющих субъединиц комплекса может вызывать переключение синтеза РНК с цепей отрицательной полярности на цепи положительной полярности [76].

Разумеется, из всех белков ВКЭ более полно изучен структурный белок Е.

4.3. Структура и функции белка Е

Белок Е - главный, биологически наиболее значимый компонент внешней поверхности оболочки вириона. Он играет ключевую роль в процессах сборки вирусной частицы, в связывании вируса с клеточной поверхностью и последующем слиянии вирусной и клеточной мембран - определяет тропизм вируса. При сборке вириона нуклеокапсид вирусной частицы диаметром 26-30 нм, состоящий из вирусной РНК и внутривирусного нуклеокапсидного белка С, заключается в липидный бислой, происходящий из плазматической мембраны клетки-хозяина и вирусных поверхностных белков preМ и Е. Таким образом, гликопротеин Е и белок preМ (после созревания и выхода вируса из клетки - белок М) включены в состав липопротеиновой оболочки вируса, однако, пространственно выступают на поверхности собранной вирусной частицы.

При обработке очищенного вирусного препарата трипсином или детергентами белок Е ВКЭ легко отщепляется от поверхности вириона в растворимом состоянии. Сохраняющаяся при этом интактная структура белковой глобулы была изучена рентгеноструктурным анализом [72]. На рис. 3 представлена схема пространственной конфигурации полипротеинов димера поверхностного белка Е ВКЭ. Из полученных данных следует, что на поверхности вируса белок Е представляет собой отдельную объемную единицу, состоящую из комплекса двух молекул (димера) вирусного белка Е. При этом каждая молекула белка Е в димере представляет собой продолговатое образование, состоящее из трех структурных клубков-доменов (I-III), собранное определенным образом из единой полипептидной цепочки. Объемный каркас каждой молекулы в виде трех структурных доменов белка Е жестко фиксируется шестью дисульфидными мостиками, образованными 12 цистеиновыми остатками в полипептидной цепи белковой молекулы. Абсолютная консервативность цистеиновых остатков в составе белка Е и высокая гомологичность профиля гидрофильности полипептида этого белка для всех флавивирусов предполагают одинаковую пространственную структуру поверхностного белка Е флавивирусов. Надмолекулярная димерная структура поверхностного белка вируса дополнительно поддерживается межмолекулярным взаимодействием двух объемно протяженных молекул, стянутых вместе по принципу голова-хвост или валетом. В результате получается объемная симметричная структура димера с общими размерами длиной 150Е, шириной 55Е и толщиной 30Е, где боковые поверхности в основном формируются I и II парными доменами, а торцевые поверхности - доменами III и частично I двух, образующих белковый димер, молекул. Плоская структура димера располагается параллельно с поверхностью липидной бислойной мембраны вириона, и в результате, как считается, белок Е образует на поверхности вируса объемно-решетчатую сеть толщиной 30Е.

Результаты рентгеноструктурного анализа подтверждаются данными визуализации вирионов флавивирусов методом электронной микроскопии. Выступающие на поверхности вириона свободные участки димера белка Е, состоящие из двух димерообразующих парных доменов I, II и дистальных доменов III, связывают нейтрализующие вирус иммунопротективные антитела. Не удивительно, что мутации, расположенные на поверхности димера, как будет рассмотрено ниже, могут иметь серьезные последствия в патогенезе инфекции.

С использованием набора моноклональных антител (МКА) изучены иммунохимические свойства и проведено картирование антигенных детерминант на димере белка Е. На рис. 3 показаны топологические связи, серологическая специфичность и функции отдельных эпитопов, представляемых различными клонами МКА против белка Е штамма Найдорф западного серотипа ВКЭ [15].

На основании метода конкурентного связывания МКА были определены три неперекрывающиеся антигенные домена А, В и С, каждый из которых состоит из нескольких эпитопов А1-А5, В1-В5 и С1-С6, которые проявляют различные функции и серологическую специфичность. Более того, МКА выявили три изолированных эпитопа вне антигенных доменов i1-i3. Домен А содержит не только перекрестно реагирующие между различными флавивирусами эпитопы А1 и А2, но также специфические к субтипам ВКЭ эпитопы А3 и А4. Большинство эпитопов антигенного домена В специфичны к вирусам комплекса клещевого энцефалита, тогда как домен С преимущественно содержит специфические к вирусным субтипам эпитопы. Вируснейтрализующую активность проявили МКА, соответствующие эпитопам А3, А4, А5, В1, В2, В4, В5, С1 и i2. Примечательно, что эпитопы внутри каждого антигенного домена показывали одинаковые структурные свойства: чувствительность к денатурации при низких рН, протеолизу и восстановлению дисульфидной связи. Это, несомненно, подтверждает, что антигенные домены соответствуют хорошо известным стуктурным доменам белка Е.

Семь из вышеназванных эпитопов, в которых точечные мутации замещения аминокислотных остатков ведут к потере нейтрализации вируса соответствующими МКА (escape mutations), сосредоточены в двух больших не перекрывающихся участках, антигенных доменах С и А, соответствующих пространственным доменам I и II белка Е. Антигенные домены разобщены не только пространственно, но и отличаются по их чувствительности к конформационным изменениям и фрагментации. Оба антигенно реактивных участка вовлекаются в реакции нейтрализации вируса, но домен А содержит так называемые конформационные антигены, тогда как домен В - антигены, резистентные к конформационным изменениям и денатурации. Антигенный домен В, соответствующий структурному домену III белка Е, представляет собой достаточно автономное образование. Он может быть отщеплен от остальной части белковой молекулы трипсиновой обработкой нативного вириона или синтезирован отдельно, как генно-инженерный продукт, экспрессией рекомбинантной ДНК. Однако, в обоих случаях ведущая к нейтрализации вируса иммунохимическая активность антигенного домена В реализуется только при сохранности дисульфидного мостика внутри соответствующего структурного домена III белка Е. Как предполагается авторами, не исключено, что представленные отдельные эпитопы МКА составляют только части центров связывания нейтрализующих антител, составленных из фрагментов различных субъединиц белка на нативной структуре поверхности вириона. Хотя отсутствует специальное подтверждение, но часть центров нейтрализации вируса на белке Е, возможно, потеряна при получении солюбилизированного димера.

Локализация антигенных доменов на полипептидной карте белка Е показала, что структурный домен I образован N-концевыми 50 а.о. полипептида вместе с фрагментом 125-200 а.о., содержащим сайт гликозилирования белка Е, и другим фрагментом 250-300 а.о. Внутренние фрагменты полипептида 50-125 и 200-250 а.о. образуют домен II белка Е. Следующие около 100 (301-395) а.о. полипептида белка Е составляют структурный домен III. Последние 50 а.о. с самого С-конца полипептида составляют якорную цепочку белка Е в бислойной липидной мембране вириона.

Белок Е штамма Софьин дальневосточного генотипа и серотипа ВКЭ, по данным работы [16], оббелок NS3 (68949 Da), возможно, обладает протеазной, геликазной Рё СЂРёР±Рѕ-РќTР¤-азной активностями. Р’ составе третьего РєСЂСѓРїРЅРѕРіРѕ неструктурного белка NS5 (102639 Da) всех флавивирусов присутствует последовательность, характерная для Р РќРљ-зависимых Р РќРљ-полимераз РІРёСЂСѓСЃРѕРІ животных Рё растений: Gly-Asp-Asp. Белки NS3 Рё NS5, РїРѕ-РІРёРґРёРјРѕРјСѓ, необходимы для репликации РІРёСЂСѓСЃРЅРѕР№ Р РќРљ, так как РІ зараженных клетках РѕРЅРё находятся РІ околоядерной области РІ составе комплекса СЃ репликативной формой РІРёСЂСѓСЃРЅРѕРіРѕ генома. Ассоциация комплекса СЃ мембранами эндоплазматического ретикулума С…РѕР·СЏР№СЃРєРёС… клеток исключает возможность контактов СЃ системой иммунитета Рё обеспечивает репродукцию Р’РљР­ РІ организме. Р