А.Д. Аммосов. Клещевой энцефалит. Кольцово. 2002г.

Содержание

7. Методы и средства лабораторной диагностики клещевого энцефалита и их применение в клинической практике

7.1. ИФА Е антигена ВКЭ и антител к нему

Для выявления инфицирования вирусом и установления диагноза клещевого энцефалита повсеместно используются лабораторные методы иммуноферментного анализа антигенов ВКЭ и антител к ним в сыворотке крови пациента. Анализ Е антигена ВКЭ также часто используется для определения инфицированности клеща, снятого с укушенных. Эти анализы основаны на реакции взаимодействия антиген - антитело с применением меченых ферментом антител для индикации результатов. В качестве примера ниже приводятся краткие описания иммуноферментых тест-систем ЗАО «Вектор-Бест» для клинического лабораторного анализа вирусного антигена и антител к ВКЭ.

ИФА Е антигена ВКЭ. Тест-система предназначена для выявления ВКЭ в клещах и ликворе человека или животных и может быть использована в клинических и эпидемиологических исследованиях.

В наборе реагентов тест-системы фирма поставляет готовые для проведения анализа стрипированные планешеты с предварительно иммобилизованными антителами. Одностадийный анализ антигена состоит в совместном инкубировании исследуемого образца с конъюгатом моноклональных антител против Е антигена ВКЭ с пероксидазой в лунках стрипов с предварительно иммобилизованными антителами против ВКЭ. Реакционная смесь в лунках выдерживается во влажной камере 3 ч при 37°С или 16-20 ч при комнатной температуре. После удаления и промывки лунок от не связавшихся реагентов вирусный антиген в исследуемой пробе проявляется реакцией ферментного конъюгата с субстратом, дающим окрашенный раствор в течение 25-30 мин при комнатной температуре. Оптическая плотность субстрата, определяемая спектрофотометрически, пропорциональна концентрации анализируемого вирусного антигена. В наборах тест-систем от «Вектор-Бест» по желанию заказчика в качестве субстрата пероксидазы поставляются ОФД или ТМБ.

ИФА антител класса IgМ к ВКЭ. Для анализа используются готовые к применению пластиковые планшеты или стрипы с предварительно иммобилизованными антителами к IgM человека. Образец исследуемой стократно разведенной сыворотки инкубируется в течение часа при 37°С в лунках планшеты с антителами к IgM человека для связывания суммарной фракции антител класса IgM из анализируемой сыворотки. По окончании времени инкубации не связавшиеся компоненты сыворотки удаляются, и планшета промывается. Для связывания с вирусоспецифическими антителами IgM на планшете антигенов ВКЭ и меченых антител проводится вторая инкубация планшеты с предварительно смешанным реагентом антигенов ВКЭ и конъюгатом МКА к ВКЭ с ферментом-пероксидазой при тех же условиях. После второго удаления и промывки не связавшихся компонентов наличие специфических антител класса IgM к ВКЭ в исследуемой сыворотке определяется последующим проявлением активности и измерением оптической плотности окрашенного субстрата конъюгированного фермента.

Тест-система укомплектована контрольными сыворотками и всеми реагентами, готовыми для работы, снабжена соответствующей инструкцией по применению.

ИФА антител класса IgG к ВКЭ. По желанию заказчика тест-системы комплектуются готовыми к работе планшетами или стрипами с заранее иммобилизованным антигеном ВКЭ. В соответствии с инструкцией разбавленная в 100 раз исследуемая сыворотка вносится в лунки планшеты с вирусным антигеном и инкубируется в течение часа при температуре 37°С. В конце инкубации не прореагировавшие компоненты сыворотки удаляются, и планшета промывается. Затем в лунки со связавшимися антителами вносится раствор ферментного конъюгата с моноклональными антителами против иммуноглобулинов класса IgG человека. Планшета с реагентами выдерживается во второй раз в течение часа при 37°С. После удаления и промывки не связавшихся реагентов количество вирусспецифических IgG в исследуемой сыворотке определяется последующим проявлением и измерением оптической плотности окрашенного субстрата ферментного конъюгата в лунках планшеты. Набор реагентов тест-системы и ее инструкция по применению предусматривают процедуру титрования вирусспецифических IgG в сыворотке.

Тест-система выпускается в соответствии с требованиями ВФС 42-3503-99 и ее производство сертифицировано как медицинского иммунобиологического препарата.

7.2. ПЦР-анализ РНК ВКЭ

Методом молекулярной гибридизации нуклеиновых кислот с ПЦР геномная РНК ВКЭ определяется с применением молекулярных зондов - меченых фрагментов нуклеиновой кислоты, комплементарных к определенным участкам генома ВКЭ. Преимущества анализа РНК ВКЭ перед методом биопробы и анализом антигенов вируса иммуноферментным методом или методом флюоресцирующих антител стали очевидными с первых работ по выявлению РНК ВКЭ еще простым методом гибридизации нуклеиновых кислот [27, 28].

Первые результаты анализа РНК ВКЭ показали, что метод молекулярной гибридизации - более высокочувствительный тест: вирусная РНК выявлена из 50,9% исследованных проб крови больных с острым течением клещевого энцефалита. При исследовании тех же образцов крови методом биопробы на беспородных белых мышах инфекционный вирус выявлен в 23,4% случаев. По мнению авторов, столь значительное расхождение в результатах анализов в сыворотке объясняется возможной маскировкой инфекционного вируса за счет формирования иммунных комплексов. В процессе депротеинизации при выделении РНК из анализируемого образца нуклеопротеиновые комплексы диссоциируют, и освобождающаяся вирусная РНК увеличивает частоту положительных результатов гибридизационного анализа. Более частое выявление РНК ВКЭ в крови больных может быть обусловлено также значительно более активным, чем репликация инфекционных вирионов, синтезом вирусной РНК в инфицированной клетке. Чувствительность гибридизационного метода, по сравнению с биотестом, при анализе ВКЭ в клещах была выше и при постановке биотеста на сосунках белых мышей, но в меньшей степени.

ЗАО «Вектор-Бест» для анализа РНК ВКЭ в клинических образцах поставляет тест-систему ПЦР-анализа в его наиболее выскочувствительном варианте, основанном на методе обратной транскрипции с последующей «nested» полимеразной цепной реакцией (ОТ-ПЦР). Метод ОТ-ПЦР включает два этапа: на первом этапе при температуре 37°С производится реакция обратной транскрипции, т.е. после специфического связывания олигонуклеотида-праймера с вирусной РНК исследуемого образца происходит синтез вирусной кДНК с помощью обратной транскриптазы (ревертазы); на втором этапе проводится ПЦР, включающая три стадии. На первой стадии при температуре 93оС происходит денатурация гибридной двойной цепи РНК-кДНК, образовавшейся при обратной транскрипции. На второй стадии ПЦР два олигонуклеотида-праймера, строго специфичные (гомологичные) к определенным участкам антипараллельных цепей вирусной РНК и кДНК, связываются с этими участками цепей нуклеиновых кислот (т.н. стадия отжига праймеров). На третьей стадии при температуре 70-72°С с участием термофильной ДНК-полимеразы (Тth-полимераза) и дезоксинуклеозид-5’-трифосфатов происходит синтез новых цепей ДНК. Инициация синтеза ДНК происходит в местах связывания олигонуклеотидов-праймеров с вирусной РНК и кДНК, матрицей для копирования служат комплементарные цепи вирусной нуклеиновой кислоты (т.н. стадия полимеризации).

Таким образом, за цикл из трех стадий происходит удвоение каждого из двух фрагментов антипараллельных цепей вирусной нуклеиновой кислоты. При проведении 20 таких циклов теоретически происходит увеличение количества фрагмента исходной ДНК примерно в миллион раз.

Для увеличения чувствительности анализа этап ПЦР проводится в «nested»-варианте: первый раунд - с «внешней» парой олигонуклеотидов-праймеров, второй раунд - с «внутренней» парой олигонуклеотидов-праймеров и аликвотой реакционной смеси ПЦР первого раунда.

Выбранные пары праймеров из NS3-области вирусного генома позволяют выявлять строго специфично все РНК ВКЭ различных штаммов. При этом РНК других флавивирусов, в том числе - из антигенной группы ВКЭ, не выявляются. Размер специфического ампликона в первом раунде ПЦР с «внешними» праймерами - 340 пар оснований, во втором раунде ПЦР с «внутренними» праймерами - 171 пара оснований или нуклеотидных остатков. Детекцию результатов ПЦР-анализа проводят визуально после гель-электрофореза аликвоты амплифицированной ДНК в полиакриламидном геле или агарозе. Чувствительность анализа с применением описанной тест-системы - 100-200 геномов ВКЭ на исследуемую пробу. Сверхчувствительный ПЦР-анализ РНК позволяет надежно с высокой специфичностью выявлять ВКЭ в исследуемых образцах, содержащих вирус в десятки-сотни тысяч раз в меньших количествах, чем это позволяет выявлять ИФА-анализ антигена ВКЭ.

Для проведения лабораторного ПЦР-анализа РНК ЗАО «Вектор-Бест» выпускает дополнительный набор реагентов, специально предназначенный для выделения РНК из биологических образцов (крови, сывороток крови, форменных элементов крови, мочи, слюны, ликвора, соскобов со слизистой, культур клеток и пр.).

7.3. Лабораторная диагностика клещевого энцефалита

Внутри-, межочаговая и региональная генетическая гетерогенность ВКЭ приводит к широкому структурному разнообразию эпитопов каждого из антигенов вируса. В результате среди циркулирующих в природе штаммов вируса значительную часть составляют антигенно-дефектные варианты. Сущность явления антигенной дефектности заключается в отсутствии гемагглютинирующего и преципитирующего антигенов и слабой иммуногенности на фоне высокой инфекционной активности вируса. В этих условиях основу иммунологических методов анализа специфических вирусных антител составляют реакции связывания только вируснейтрализующих антител, продуцируемых у лиц, инфицированных антигенно-дефектными вирусами в низких титрах. В природных популяциях ВКЭ доля соответствующих дефектных штаммов может достигать 30-40% [29]. Лица, инфицированные антигенно-дефектными штаммами, в клинике образуют группу т.н. серонегативных больных и больных с низкими стабильными титрами.

При иммунологических методах определения ВКЭ некоторая неопределенность в оценке результатов анализа также возникает из-за того, что препараты меченых антител могут связываться с вирусами различных серотипов ВКЭ с разной эффективностью. Также требуется проверка специфичности меченых антител относительно реакции связывания с другими флавивирусами группы клещевого энцефалита. По этим причинам в последнее время в производстве ИФА-диагностикумов для клинического анализа в качестве меченых антител к ВКЭ используются моноклональные антитела, связывающиеся с определенным эпитопом Е-антигена ВКЭ, общим для известных серотипов этого вируса.

Клиническое распознавание клещевого энцефалита на первом этапе основывается на известных клинико-эпидемиологических данных. В большинстве наблюдений удается установить предшествующее пребывание человека в лесу, укус клеща или возможность употребления им сырого инфицированного молока. Сразу оценивается вероятная продолжительность инкубационного периода, а клинические исследования могут выявить нейроинфекционный характер болезни. Предварительный диагноз должен быть подтвержден лабораторным методом [3]. На практике диагноз клещевого энцефалита, как правило, устанавливается применением ИФА при четырехкратном нарастании титра вирусспецифических антител в парных сыворотках. Повторное обследование можно провести спустя 7-10 дней. Обычно антитела в высоких титрах обнаруживаются на 10-14-й день болезни, а иногда и раньше, и достигают высокого уровня к концу месяца. Даже однократное определение высокой концентрации вирусспецифических иммуноглобулинов класса IgM следует считать достоверным свидетельством в пользу клинического диагноза клещевого энцефалита. Ранние антитела IgM в сыворотке пациентов выявляются, начиная с первых дней после укуса клеща. Чувствительность применения ИФА вирусспецифических антител класса IgM для диагностики максимальна в первой десятидневке после инфицирования. Антитела класса IgG в максимальных титрах выявляются в течение 2-6 мес. после инфицирования. Однако, следует учитывать отсутствие антител или весьма низкий уровень продукции их у части больных в титрах не выше 1:640. При этом следует иметь в виду возможность обнаружения специфических антител в низких титрах в течение длительного времени у вакцинированных. Поэтому для подтверждения диагноза часто рекомендуется применение высокочувствительного ПЦР-анализа для определения РНК ВКЭ. Определение вирусной РНК при клещевом энцефалите в образцах сыворотки, ликвора, в зависимости от сроков выявления и корреляции с определенными соотношениями уровней специфических антител IgM и IgG, может служить для диагностики серонегативной формы клещевого энцефалита, затяжной реконвалесценции, прогноза второй волны лихорадки клещевого энцефалита и возможности хронизации процесса [58, 82].

В последнее время ПЦР-анализ РНК ВКЭ, метод ИФА для индикации вирусного антигена в клещах, снятых с людей, все чаще применяются для прогноза риска заболевания клещевым энцефалитом. При положительных результатах тестирования рекомендуется экстренная серопрофилактика укушенного путем внутримышечного введения специфического противоэнцефалитного человеческого иммуноглобулина [59].

Дифференциальная диагностика должна учитывать возможность заболевания пациента японским энцефалитом, геморрагической лихорадкой с почечным синдромом, энтеровирусным менингитом, клещевым риккетсиозом, болезнью Лайма (боррелиозом) и др.

Предыдущая страница | Страница 8 из 11 | Следующая страница

Читайте также:
»Иксодовые клещи и клещевые инфекции
»Сыпной тиф
»Эндемический (крысиный или блошиный) сыпной тиф
»Клещевой риккетсиоз
»Средиземноморская (марсельская) лихорадка
»Астраханская пятнистая лихорадка
»Фото переносчиков клещевого энцефалита