И.Н. Манзенюк, О.Ю. Манзенюк. Клещевые боррелиозы (болезнь Лайма). Кольцово. 2005 г.

Содержание

7. СЕРОЛОГИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ДИАГНОСТИКИ КЛЕЩЕВЫХ БОРРЕЛИОЗОВ

Определение антител к B. burgdorferi sensu lato в сыворотке крови, цереброспинальной и внутрисуставной жидкостях в настоящее время является основным методом диагностики клещевых боррелиозов, особенно у больных с диссеминированной или хронической стадиями инфекции. Для этой цели используются как классические методы серологической диагностики, такие как реакция непрямой иммунофлюоресценции, РСК, РПГА, так и более современные высокочувствительные методы диагностики на основе непрямого иммуноферментного анализа (ИФА или ELISA) и иммунного блоттинга.

Специфические иммуноглобулины к антигенам боррелий обычно начинают определяться у пациентов на 3–6-й неделе после начала инфекции. Изучение развития иммунного ответа у нелеченных больных Лайм-боррелиозом показало, что иммуноглобулины класса M начинают обнаруживаться на 2–4-й неделе после начала инфекции. Образование специфических IgM у инфицированных лиц обычно предшествует появлению иммуноглобулинов класса G. Однако у некоторых больных синтез IgM может задерживаться или отсутствовать вообще. На ранней стадии боррелиозной инфекции оба класса специфических иммуноглобулинов синтезируются в основном против ограниченного числа антигенов, в частности, против флагеллина (р41) и наружного поверхностного протеина (OspC) B. burgdorferi sensu lato.

При использовании антител к OspC в качестве серологического маркера, необходимо учитывать высокую видовую специфичность этого белка и возможность получения ложноотрицательных результатов. Рекомбинантный OspC B. afzelii и B. gariniiболее эффективен для выявления IgM, чем рекомбинантный белок, соответствующий по структуре OspC B. burgdorferi sensu stricto. Иммуноглобулины класса M к OspC наблюдались у 25–80% больных с мигрирующей эритемой и у 48–72% больных нейроборрелиозом. Совместное использование рекомбинантных OspC и внутреннего фрагмента флагеллина (14 кДа) в ИФА повышает выявляемость специфических IgM [18, 73].

Показано, что сероконверсия наблюдается у 20–50%, а по некоторым данным, у 80% больных ранним боррелиозом (I стадия) [18, 184]. Достоверность анализа зависит от методов диагностики и критериев, используемых на этом этапе инфекции. При раннем боррелиозе с целью установления сероконверсии важно исследовать парные сыворотки, полученные от пациентов с интервалом в 20–30 дней. Специфические иммуноглобулины класса M детектируются у 70–90% пациентов с боррелиозом при I стадии, у 30–80% – при II стадии и у 5–48% – при III стадии. Специфические IgG выявляются у больных с I стадией – в 50–70% случаев, II стадией – в 65–100%, III стадией – до 100% [18, 184, 187].

Наличие IgМ к антигенам боррелий в сыворотке крови больных Лайм-боррелиозом, как правило, указывает на раннюю стадию инфекции. Однако в некоторых случаях IgM могут выявляться в течение 1–2 лет. Важно отметить, что оба класса специфических иммуноглобулинов (G и М) могут детектироваться в течение длительного периода времени (более 10 лет). Долго они сохраняются также и после успешно проведенной антибиотикотерапии [18, 205]. По мнению ряда авторов [18, 206, 207], серологический анализ не подходит для контроля эффективности лечения из-за отсутствия доказательств элиминации боррелий. Так, показано, что после антибиотикотерапии Лайм-артрита возможно увеличение уровня антител. В то же время выявление IgM в отсутствии сероконверсии при анализе парных сывороток, вероятнее всего, свидетельствует о ложноположительном результате анализа.

Иммуноглобулины класса G вырабатываются против целого ряда боррелиозных антигенов, пик синтеза данного класса антител приходится на 6–8-ю неделю после начала инфекции. Их наличие, как правило, характеризует острую диссеминированную или хроническую органную манифестацию инфекции (II и III стадии). Выявление IgG при раннем боррелиозе, при отсутствии IgM и клинической симптоматики заболевания, возможно, указывает на предшествующий контакт с боррелиями, который пациент не зафиксировал вследствие бессимптомного или абортивного течения инфекции. При наличии признаков поражения центральной нервной системы необходимо проводить анализ специфических антител в спинномозговой жидкости, так как отрицательный результат анализа сыворотки крови у больного нейроборрелиозом не свидетельствует об отсутствии у него инфекции. Для позднего боррелиоза характерно значительное повышение титров IgG, особенно при атрофическом акродерматите (до 100% случаев). В литературе описаны немногочисленные примеры серонегативного Лайм-боррелиоза с клинически неясными симптомами, что, в основном, обусловлено иммуносупрессией разного генеза. В таких случаях для адекватной диагностики особо значимым является обнаружение у обследуемых лиц непосредственно возбудителя инфекции [18].

Методология серодиагностических исследований

Согласно рекомендациям Второй национальной конференции по серологической диагностике болезни Лайма (октябрь 27–29, 1994 г., США), для выявления активной инфекции используют двухшаговый принцип серологической диагностики, который значительно величивает эффективность исследования [208]. С этой целью на первом этапе серологического обследования рекомендуют использовать чувствительный иммуноферментный или иммунофлюоресцентный тест, на втором – последующее подтверждение результатов анализа с помощью метода иммунного блоттинга, который позволяет выявить ложноположительные результаты, полученные на первом этапе исследования, и тем самым существенно повысить специфичность анализа. Однако серодиагностика болезни Лайма существенно осложняется антигенной гетерогенностью представителей B. burgdorferi sensu lato, оказывающей негативное влияние на показатели чувствительности и специфичности используемых диагностических тест-систем.

Реакция непрямой иммунофлюоресценции

Реакция непрямой иммунофлюоресценции (РНИФ) является первым методом, широко примененным для серодиагностики боррелиозов. Основной компонент, используемый для постановки РНИФ, – инактивированные боррелии (корпускулярный антиген), фиксированные на предметном стекле. Инкубация сыворотки больного с корпускулярным антигеном приводит к связыванию специфических антиборрелиозных антител. Визуализацию комплекса антиген-антитело осуществляют с помощью иммунофлюоресцентной антисыворотки против иммуноглобулинов человека и учетом результатов анализа в люминесцентном микроскопе [18]. Метод прост и недорог в исполнении, обладает неплохой чувствительностью, но недостаточно специфичен из-за наличия перекрестных реакций с другими микроорганизмами, в частности, с Treponema pallidum.

Учитывая высокий уровень заболеваемости сифилисом в России, который в 1990-х годах приобрел характер эпидемии, процент ложноположительных реакций при использовании РНИФ достаточно высок. Тем не менее, в течение последнего десятилетия серодиагностика клещевых боррелиозов в Российской Федерации проводилась, в основном, методом РНИФ. В качестве антигена обычно использовался штамм Ip-21 B. afzelii [209]. Диагностически значимым в РНИФ считают титр специфических антител 1:40 и выше.

Иммуноферментный метод серодиагностики

Иммуноферментный анализ (ИФА) антител к антигенам B. burgdorferi sensu lato в настоящее время является основным методом, применяемым в развитых странах в лабораторной диагностике клещевых боррелиозов. Особое значение в создании стандартизованных тест-систем, обладающих высокой диагностической эффективностью, имеет выбор антигенов, используемых в качестве иммуносорбента. С этой целью применяют: грубые экстракты боррелий, нативные очищенные антигены, рекомбинантные антигены боррелий комплекса B. burgdorferi sensu lato и синтетические пептиды.

Лизаты и ультразвуковые сонификаты боррелий являются плохо стандартизуемыми препаратами, хотя они и обеспечивают достаточную степень чувствительности. Их использование в значительной степени ограничивается наличием широкого спектра неспецифических реакций. С целью увеличения специфичности анализа без снижения его чувствительности в качестве антигенов применяют экстракты иммунодоминантных белков боррелий, выделенных из спирохет с помощью детергентов. Кроме того, в качестве иммуносорбента используется также очищенный флагеллин боррелий («IDEIA Borrelia burgdorferi IgG/IgM», Dako) [18, 210].

Конструирование и композиция стандартизованных высокоочищенных рекомбинантных антигенов боррелий, имеющих преимущественное распространение в конкретном регионе, в частности, на территории Российской Федерации, – ключ к созданию высокоэффективного диагностикума. Применение в ИФА сочетания нескольких рекомбинантных белков B. burgdorferi sensu lato позволяет сгладить гетерогенность внутривидовых антигенных различий между боррелиями, дает возможность объединить антигены известных патогенных видов боррелий (B. burgdorferi sensu stricto, B. afzelii, B. garinii), а также максимально снизить перекрестные реакции к возбудителям других инфекций (лептоспирам, трепонемам, цитомегаловирусу, вирусу Эпштейна-Барра и т.д.).

Анализ литературы свидетельствует о широком использовании в клинической практике коммерческих иммуноферментных наборов различных фирм-производителей, в которых в качестве иммуносорбента используются нативные или рекомбинантные белки боррелий [211, 212]. В современных диагностических наборах часто применяют комбинацию нескольких рекомбинантных полипептидов – аналогов нативных белков двух или трех видов боррелий. К таким рекомбинантным антигенам относятся: внутренний фрагмент флагеллина (р41i), белки р83/100, BmpA(р39), р18, OspC, DbpA, DbpB, BBK32 и пептидный антиген VlsE вариабельного региона 6 (IR(6)) от B. afzelii, B. garinii и B. burgdorferi sensu stricto, которые значительно улучшают качество серологической диагностики клещевых боррелиозов [213–218].

Предыдущая страница | Страница 8 из 13 | Следующая страница

Читайте также:
»Иксодовые клещи - переносчики клещевых инфекций
»Лихорадка Западного Нила
»Как удалить клеща
»Средства и методы защиты от клещей
»Иммуноглобулин (противоклещевой)
»Адреса лабораторий по исследованию клещей
»Вопрос-ответ
»Фото переносчиков клещевого боррелиоза (болезни Лайма)