И.Н. Манзенюк, О.Ю. Манзенюк. Клещевые боррелиозы (болезнь Лайма). Кольцово. 2005 г.

9. ПОДТВЕРЖДАЮЩИЕ ТЕСТЫ

В настоящее время в качестве подтверждающего теста при серологической диагностике клещевых боррелиозов используют метод иммунного блоттинга с «нативными» цельноклеточными лизатами или рекомбинантными антигенами боррелий [18, 184, 222, 223]. Данный метод позволяет определить спектр специфических антител, синтезируемых у обследованного больного к различным антигенам боррелий. Иммуноблот является более специфичным и информативным тестом, чем иммуноферментный метод. В то же время в классическом понимании боррелиозный иммуноблот не является подтверждающим тестом по сравнению с ВИЧ-иммуноблотом. Это связано со сложностью интерпретации его результатов, поскольку не всегда возможно дифференцировать активную инфекцию от ранее перенесенной или дать четкий положительный ответ при раннем боррелиозе (I стадия).

Основными критериями отбора коммерческого иммуноблота для клинической диагностики клещевых боррелиозов являются удобство чтения и интерпретации результатов анализа, основанной на идентификации антител к различным антигенам. Метод иммуноблота является скорее качественным, чем количественным, и не может быть использован для мониторинга эффективности проводимого лечения. При проведении серологической диагностики клещевых боррелиозов все образцы, показавшие при первичном тестировании положительные или сомнительные результаты, должны быть подтверждены в стандартизованном IgG и/или IgM иммуноблоте. Для пациентов с подозрением на ранний боррелиоз рекомендуется использовать иммуноблот, выявляющий как специфические IgG, так и IgM.

Согласно рекомендациям Второй национальной конференции по серологической диагностике болезни Лайма и Center for Diseases Control (CDC) (США) [208], результат иммуноблота для определения IgM считают положительным, если в нем выявляется две из трех полос антигенов: 24 kDa (OspC – молекулярный вес варьирует), 39 kDa (BmpA) и флагеллин – 41 kDa (Fla). Для иммуноблота по выявлению IgG в положительном варианте ответа должны выявляться минимум пять из 10 полос, соответствующие следующим антигенам: 18 kDa, 21 kDa (OspC – молекулярный вес варьирует), 28 kDa, 30 kDa, 39 kDa (BmpA), 41 kDa (Fla), 45 kDa, 58 kDa (не GroEL), 66 kDa и 93 kDa. Однако данные рекомендации, как показано различными группами исследователей, не совсем подходят для Европы и, в частности, для России. В первую очередь это обусловлено антигенной гетерогенностью штаммов и видов B. burgdorferi sensu lato [224–227].

В настоящее время считают, что некоторые из антигенов боррелий важны для детекции специфических IgG: Osp17, р21, p39, p41, p66, p83/100 (p93) из штаммов B. afzelii; p14, p41, p93 из штаммов B. garinii и OspA, OspC, p93 из штаммов B. burgdorferi sensu stricto. Наиболее часто специфические IgM в иммуноблоте обнаруживают к p18, OspC, p39, p41 из штаммов B. afzelii; p39, p41, p66, p83 из штаммов B. garinii и OspC, OspA из штаммов B. burgdorferi sensu stricto. Однако спектр антител к различным антигенам, выявленный в иммуноблоте, может варьировать в зависимости от стадии инфекции [228–230]. В регионах с высоким уровнем заболеваемости клещевым боррелиозом, где от 10 до 20% человеческой популяции содержат антитела к B. burgdorferi sensu lato, а в некоторых группах населения (охотники, лесничие и т. д.) процент выявления антител к боррелиям может достигать 40%, метод иммунного блоттинга используют в качестве альтернативы иммуноферментному методу диагностики.

Иммуноблот на основе нативных антигенов боррелий

Для данного вида иммуноблота, как правило, используют ультразвуковой сонификат, полученный из чистых штаммовых культур одного из видов B. burgdorferi sensu lato. Основным недостатком данного вида иммуноблота является присутствие в нем, кроме высокоспецифичных антигенов боррелий, ряда низкоспецифичных белков, которые могут существеныно осложнить интерпретацию результатов тестирования из-за наличия перекрестных реакций. Наиболее важным моментом в создании такого иммуноблота является надежная идентификация белков, соответствующих каждой полосе электрофореграммы. Такой контроль осуществляется с помощью панели моноклональных антител к иммунодоминантным белкам боррелий. Однако вариабельность иммунодоминантных антигенов патогенных для человека видов боррелий значительно ограничивает использование иммуноблотов на основе нативных антигенов для диагностики боррелиоза.

Иммуноблот с использованием рекомбинантных белков

Использование для данного вида иммуноблота композиции иммунодоминантных, высокоочищенных и высокоспецифичных рекомбинантных белков боррелий сделало доступным для клинической практики подтверждающие тесты высокой специфичности и чувствительности. Проблемой при производстве таких тестов является подбор концентраций рекомбинантных антигенов, определяющих параметры их диагностической эффективности. Использование комбинации из нескольких рекомбинантных белков от двух или трех видов боррелий позволяет сгладить антигенную гетерогенность между различными генотипами боррелий, повысить чувствительность и специфичность иммуноблота, выявить специфические антитела ко всем трем видам боррелий (B. burgdorferi sensu stricto, B. garinii, B. afzelii) в одном анализе.

Улучшение чувствительности рекомбинантного иммуноблота наблюдается при использовании полипептидов, соответствующих наиболее значимым иммуногенным детерминантам белков (например, VlsE или пептид С6 из его аминокислотной последовательности) и комбинации гомологичных белков от различных геновидов боррелий (например, DbpA и BBK32) [211, 215, 216, 231, 232].

Рациональная (двухшаговая) схема серологической диагностики боррелиоза

В США и Европе в течение последнего десятилетия широко используют двухшаговый метод серодиагностики Лайм-боррелиозов [208, 225, 233], обладающий высокой специфичностью и чувствительностью. Основным скрининг-тестом в этой схеме является ИФА. Исследуемые образцы с положительными или сомнительными результатами в ИФА обязательно дополнительно тестируют методом иммунного блоттинга (см. схему). К сожалению, такой двухшаговый подход к серодиагностике боррелиоза практически не применяется в нашей стране.

Следует отметить, что интерпретация результатов серологического анализа осложняется при отсутствии эпидемиологического анамнеза и клинических симптомов заболевания. Кроме того, жители эндемичных по клещевым боррелиозам территориям нередко являются серопозитивными [18, 24], поэтому в таких регионах частота обнаружения асимптоматической инфекции может быть значительной. Так, в результате исследований, проведенных в Швеции, показано, что более половины пациентов, имеющих положительный результат в иммуноферментном анализе, не имели никаких симптомов, подтверждающих Лаймборрелиоз [234].

Схема проведения серологического анализа

При клинических испытаниях вакцины, используемой для специфической профилактики болезни Лайма, было отмечено, что у 137 здоровых добровольцев контрольной группы, для иммунизации которых использовали плацебо, наблюдалась сероконверсия, подтвержденная методом иммунного блоттинга. У 28 человек этой группы (20%) при этом отсутствовали клинические симптомы клещевого боррелиоза [235].

Причины получения ошибочных результатов

Несмотря на постоянно ведущиеся исследования по совершенствованию тест-систем для серодиагностики клещевых боррелиозов, при их применении в лабораторной клинической практике возможно получение как ложноположительных, так и ложноотрицательных результатов анализа [236, 18, 237, 238].

Причины получения ложноотрицательных результатов:

1. Отсутствие или низкие уровни антител при ранней стадии инфекции (серологическое окно) как результат задержки иммунного ответа, обусловленного особенностями возбудителя.

2. Антигенная гетерогенность возбудителя, которая не позволяет осуществить диагностику в используемой тест-системе.

3. Иммуносупрессия, обусловленная как инфекционной (ВИЧ-1 инфекция и др.), так и неинфекционной патологией.

4. Ложноотрицательные результаты при определении IgM из-за высоких значений специфических IgG.

5. Недостаточная чувствительность тест-системы из-за неоптимального подбора используемых в ней рекомбинантных антигенов.

Причины получения ложноположительных результатов:

1. Перекрестные реакции с инфекциями, вызванными спирохетами, особенно c возбудителями сифилиса и лептоспироза, а также возбудителями возвратного тифа B. hermsii и B. duttoni (как правило, за счет общих антигенных детерминант); представителями герпесвирусной группы, в частности с вирусом Эпштейна-Барра, цитомегаловирусом (из-за неспецифических реакций в результате поликлональной стимуляции Bклеток); энтеробактериями; иерсиниозами; кампилобактериозами; сальмонеллами; нейссериями; пневмо-, стафилококками; микобактериями; инфекционным мононуклеозом и т. д.

2. Наличие аутоиммунных (системная красная волчанка и т. д.), ревматоидных (ревматоидный артрит и т. д.) и гематологических заболеваний.

Альтернативные методы

Эти методы в настоящее время имеют весьма ограниченное применение. К ним относятся: экспресс-тест «PreVue», основанный на обнаружении в крови пациента антител к возбудителю инфекции, выявляемых при помощи генетических маркеров; лабораторный тест, применяемый для исследовательских целей, с использованием метода проточной цитометрии. Тест позволяет определять уровень цитотоксических (вызывающих гибель боррелий) антител в сыворотке крови больного с клещевым боррелиозом.

Предыдущая страница | Страница 10 из 13 | Следующая страница

Читайте также:
»Иксодовые клещи - переносчики клещевых инфекций
»Лихорадка Западного Нила
»Как удалить клеща
»Средства и методы защиты от клещей
»Иммуноглобулин (противоклещевой)
»Адреса лабораторий по исследованию клещей
»Вопрос-ответ
»Фото переносчиков клещевого боррелиоза (болезни Лайма)