К проблеме изменчивости генома вирусов клещевого энцефалита

Флавивирусы, переносчиками которых являются членистоногие (преимущественно клещи и кровососущие двукрылые), широко распространены в умеренной, субтропической и тропической климатических зонах. Естественные хозяева флавивирусов из числа теплокровных позвоночных переносят инфекцию в большинстве случаев бессимптомно. У человека, являющегося случайным звеном, флавивирусные инфекции протекают тяжело, могут иметь летальный исход или вызывать инвалидность. Генетическая детерминированность ряда биологических свойств вирусов делает актуальным изучение вопросов изменчивости первичной структуры и закономерностей кодирования генома. Нуклеокапсид вирусной частицы флавивирусов, включающий в себя капсидный белок С и геномную +РНК, окружен липидной мембраной, в которую включены М (мембранный) и Е (оболочечный) белки. В геномной РНК флавивирусов закодированы три структурных (С, М и Е) и семь неструктурных белков (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B, NS5), последовательно считываемых в единой рамке считывания и необходимых для размножения вируса в клетках хозяина (Grard et al., 2007; Tuplin et al., 2011). В 5' и 3' - некодирующих концевых последовательностях, обрамляющих рамку считывания, содержатся регулирующие элементы РНК, которые предположительно участвуют в формировании вторичной структуры РНК и контролируют многочисленные РНК-РНК и РНК-белковые взаимодействия, необходимые для осуществления репликации. Для большинства флавивирусов существует общая схема расположения регулирующих элементов РНК, сохраняющихся вторичных структур РНК, консервативных и вариабельных участков генома (Thurner et al., 2004). Известно также, что вторичная структура РНК очень чувствительна к возникновению мутаций. Поэтому выявление закономерностей при возникновении таких мутаций и их связи с особенностями строения каждого вируса вызывает большой интерес исследователей и требует применения различных статистических методов (Firth, Atkins, 2009). Значимость синонимичных и несинонимичных замен для изменения свойств вируса определяется, как правило, местом их возникновения (Marin, 1995; Tuplin et al., 2011), которое может соответствовать расположению регулирующих элементов РНК. Поэтому при исследовании вирусного генома и оценке его изменчивости следует учитывать не только количество различий между нуклеотидными последовательностями, но и место возникновения мутации, а также наличие возможных связей между отдельными точечными мутациями в разных частях генома.

Целью нашего исследования были сравнение кодирующих нуклеотидных последовательностей флавивирусов, передаваемых клещами, оценка вероятности возникновения пар коррелированных точечных нуклеотидных замен в различных частях вирусной РНК и сопоставление выявленных корреляций с известными структурными особенностями вирусных РНК.

Материалы и методы. В исследовании использованы полноразмерные нуклеотидные последовательности флавивирусов, передаваемых клещами, полученные из банка данных EMBL в режиме свободного доступа (коды доступа в банке: АВ062063, АВ062064, АВ507800, AF069066, AF253419, AF253420, AF527415, АМ600965, AY169390, AY182009, AY193805, AY217093, AY323490, AY438626, DQ153877, DQ401140, DQ486861, DQ862460, DQ989336, EF469661, EF469662, EU480689, EU543649, EU670438, EU770575, EU790644, EU816450, EU816451, EU816452, EU816453, EU816454, EU816455, FJ402885, FJ402886, FJ572210, FJ906622, FJ968751, FJ997899, GQ228395, GQ266392, GU121642, НМ055369, НМ120875, НМ440558, НМ440559, НМ440560, НМ440561, НМ440562, НМ440563, НМ535610, НМ535611, НМ859894, НМ859895, HQ201303, JF316707, JF316708, L06436, М0361, U27491, U27495,U39292).

Выравнивание последовательностей и построение филогении проводили с помощью программы ClustalX (1.8) (метод множественного выравнивания нуклеотидных последовательностей (Multiple Alignments) со следующими значениями параметров GAP OPENING=20, DELAY DIVERGENT SEQUENCES=30 %, TRANSITION WEIGHT=0,6; метод связывания соседей (Neighbour Joining), расчет филогенетических деревьев проводили при значении параметра bootstrap replicates > 1000).

Обнаружение корреляций при возникновении мутаций в разных частях вирусной РНК велось путем сравнения замен в массивах выровненных последовательностей (Тюлько, Якименко, 2003; Тюлько, Якименко, 2008). Для анализа была взята только кодирующая часть РНК, т.к. некодирующие части не всегда представлены в генетических банках полностью, а 3' - некодирующая концевая последовательность имеет очень вариабельные участки, мешающие выравниванию. При сравнении нуклеотидных последовательностей в качестве меры подобия использовалось значение взаимной информации - MJ. Удвоенное значение MJ распределено как случайная величина х2, что позволяет оценить вероятность случайной взаимосвязи двух символьных последовательностей в одном испытании и выбрать значение минимального уровня взаимной информации MJmin, обеспечивающее обнаружение статистически значимой взаимосвязи последовательностей с заданной вероятностью ошибки. В массивах выровненных последовательностей сравнивались столбцы с разными координатами, отсчитываемыми от первого нуклеотида в кодирующей части последовательности. В результате для каждого столбца с номером i в массиве выровненных последовательностей был получен набор значений MJij характеризующий возможную связь между заменами нуклеотидов этой позиции с заменами во всех других позициях последовательности.

Результаты и обсуждение. Анализ наличия корреляций при возникновении мутаций в разных частях РНК флавивирусов млекопитающих, передаваемых с клещами, выявил многочисленные случаи (n = 841) значимых корреляций, отражающих систему сложных взаимодействий, между разными участками вирусной РНК, а также между белками и РНК Наибольшее количество корреляций при возникновении нуклеотидных замен (43) приходится на нуклеотид G (№ позиции 2489 в последовательности АМ600965), расположенный на участке, кодирующем NS1. При этом наблюдаются корреляции между заменами в этой позиции и заменами нуклеотидов, расположенных в кодирующей последовательности каждого из белков. Известно, что NS1 участвует в ранних репликационных событиях, способен образовывать комплекс с NS4A, а также взаимодействовать с другими белками (Lindenbach, Rice, 1999), чем, возможно, и объясняется наличие большого количества корреляций при возникновении замен.

Обнаруженные случаи корреляций распределяются неравномерно вдоль последовательности и затрагивают достаточно удаленные друг от друга участки. Для большинства этих участков неизвестны особенности вторичной структуры РНК или белков, которые они кодируют. Однако сопоставление координат нуклеотидных замен, для которых выявлены значимые корреляции, с предполагаемой вторичной структурой РНК (Hiplin et al., 2011) на исследованном ранее участке с координатами 1-330 (кодон инициации трансляции здесь занимает позиции 133-135 нуклеотидов, далее - н.) показало, что положение таких нуклеотидов соответствует трем неспаренным участкам шпилечных структур, обозначенных авторами исследования (Tuplin et al., 2011) как SL4 (140 н.), SL6 (217 н., 219 н.), и шпилечной структурой, не имеющей обозначения (299 н.).

Экспериментальные данные о мутациях (Tuplin et al., 2011), вызванных в районе структуры SL6, показывают, что эта шпилька участвует в регуляции кинетики размножения вирусов. Механизм регуляции неясен, но предполагается, что это энхансерный элемент, регулирующий репликацию. Такой тип регулятора должен взаимодействовать с соответствующими ему структурами, расположенными в других частях РНК или определенных белков. Корреляции замен, обнаруженные нами для нуклеотидов с координатами 217 н. и 219 н., подтверждают эту точку зрения, так как показывают наличие связанных с ними нуклеотидных замен, возникающих в последовательностях, кодирующих структурный белок Е и неструктурные белки NS3, NS4B, NS5. Показано также наличие корреляций между заменами, возникающими в структуре SL4 (140 н.), и шпилечной структурой, не имеющей обозначения (299 н.).

Обращает на себя внимание то обстоятельство, что наибольшее влияние на кинетику размножения вирусов (Tuplin et al., 2011) имели те мутации на участке РНК, формирующем структуру SL6, которые вызывали деформации стебля шпильки и не затрагивали консервативный мотив в ее вершине. Такой эффект можно объяснить необходимостью корреляций при возникновении нуклеотидных замен, которые были обнаружены для нуклеотидов в неспаренном участке стебля (координаты 217 н. и 219 н.). Ведь наличие таких корреляций должно объясняться тем, что изменение конформации одной шпилечной структуры из-за мутации должно быть скомпенсировано изменением в другой структуре РНК для осуществления успешного взаимодействия между ними, т.к. только такие мутанты смогут успешно реплицироваться и пройти отбор. Некоторым подтверждением этого может служить то, что в опытах с адаптацией вируса клещевого энцефалита к клеткам ВНК-21 было отмечено возникновение в процессе адаптации как несинонимичных (меняющих строение белка), так и синонимичных замен, меняющих только вторичную структуру РНК (Mandi et al., 2001).

Дальнейшее сопоставление местоположения выявленных корреляций при возникновении мутаций в разных частях РНК флавивирусов с положением сохраняющихся структур РНК, обнаруживаемых различными методами, поможет составить представление о взаимодействиях этих структур друг с другом и их функционировании в вирусном геноме.

»Испытание препаратов Фитоверм и Фос против иксодовых клещей в республике Алтай

»Клинико-эпидемиологический анализ клещевого боррелиоза в Краснодарском крае

»Молекулярно-генетическая характеристика штаммов вируса клещевого энцефалита, обладающих различной патогенностью для человека

»Мультизараженность иксодовых клещей возбудителями вирусно-бактериальных инфекций в республике Беларусь

»Новый очаг клещевого риккетсиоза в Называевском районе Омской области

»Клинико-эпидемиологические особенности иксодового клещевого боррелиоза на территории Саратовской области