Разработка приемов повышения чувствительности методов выделения риккетсий

Основные направления эпидемиологического надзора за риккетсиозами
Конструирование и сравнительное испытание иммуноферментных коньюгатов
Результаты сопоставления методов мониторинга риккетсий группы клещевых пятнистых лихорадок
Разработка приемов повышения чувствительности методов выделения риккетсий
Использование методов микроанализа для идентификации штаммов риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки
Заключение

Наиболее эффективно влиял на репродукцию риккетсий в развивающихся куриных эмбрионах фтористый натрий. При заражении R. sibirica контрольных (без NaF) куриных эмбрионов накопление риккетсий на ++ и более отмечено в 13,0 %, с фтористым натрием, вводимым вместе с овокультурой, — в 44,0 %, при заражении овокультурой R. conorii в контрольных (без стимулятора) куриных эмбрионах накопление риккетсий на ++ не отмечено, с фтористым натрием - в 16,7 %. Фтористый натрий угнетает метаболизм клеток за счет снижения гликолиза при фоо форилировании (П.Ф. Здродовский, Е.М. Голиневич, 1972). По нашим данным, он вызывает также удлинение сроков выживание куриных эмбрионов, что, надо полагать, также способствует более эффективному накоплению риккетсий. В доступной нам литературе данных по влиянию фтористого натрия на накопление R. sibirica и R. conorii в желточных мешках куриных эмбрион выявить не удалось. Методический подход по использованию фтористого натрия для увеличения выхода биомассы риккетсий данных видов на куриных эмбрионах был использован для более эффективного получения цельнорастворимых антигенов штаммов R. sibirica «105/87» и «107/87», R. conorii «МК-1». Применение в качестве возможных биостимуляторов инсулина, гидрокортизона, пиридоксина (витамина В6) в выбранных дозировках не дало выраженного увеличения выхода биомассы риккетсий.

Для повышения эффективности первичной изоляции риккетсий из клещей с помощью культур клеток отрабатывались различные модификации культур клеток МК-2 (в микрокультурах - в лунках планшетов для иммунологических реакций, в пенициллиновых флаконах) и состав культуральных сред, включая биологически активные вещества (дифосфопиридиндинуклеотид, фтористый натрий, гидрокортизон), различные варианты и дозы антибиотиков. В серии экспериментов по отработке методики микрокультур клеток (11 опытов) проведен подбор оптимальной концентрации клеток МК-2 для посадки на пластиковую микропанель (450-500 тысяч клеток/мл посадочной среды). В опытах по инфицированию клеток были использованы штаммы R. sibirica «Нецветаев», «54/88» и «10/91». Все штаммы предварительно культивировали на куриных эмбрионах, для заражения культуры клеток в лунках планшетов для иммунологических реакций (микрокультура клеток) использовали желточные мешки с накоплением риккетсий на ++ или +++. Отработаны ростовая и поддерживающая питательные среды (на основе среды Игла). Проведен подбор доз антибиотиков, не оказывающих существенного влияния на репродукцию риккетсий. В поддерживающую среду добавляли пенициллин, пенициллин в сочетании со стрептомицином, канамицин в концентрациях 100, 200, 500, 1000 и 2000 ЕД/мл (9 опытов). При этом установлено, что выбранные антибиотики в концентрациях от 100 до 1000 ЕД/мл не вызывают заметного торможения репродукции риккетсий и могут быть использованы при первичной изоляции риккетсий из естественно инфицированных переносчиков. Методом микрокультуры было исследовано 425 экземпляров иксодовых клещей. При этом установлено, что метод может использоваться для скрининга переносчиков, экспериментальных работ с риккетсиями, но мало пригоден для первичной изоляции риккетсий. Это связано с возможностью контаминации из лунки в лунку, невозможностью перевести на другие модели без предварительного распассирования не менее чем в 5 лунках.

Значительная часть этих недостатков устраняется при использовании метода культуры клеток на покровном стекле в пенициллиновых флаконах: не происходит контаминации проб друг от друга, количество накопленного возбудителя достаточно для переноса на другие модели. 26 флаконов с этой модификацией культур клеток были заражены суспензиями из отдельных экземпляров переносчиков, положительных по данным МФА. Через 7-9 дней инфицированные клетки перепассировались на куриные эмбрионы, в 19 пробах с помощью МФА обнаружены риккетсий.

В серии экспериментов на микрокультуре клеток МК-2 подтверждены ранее полученные на куриных эмбрионах результаты, свидетельствующие о наибольшей эффективности применения для репродукции R. sibirica фтористого натрия, установлено стимулирующее влияние на репродукцию риккетсий в культурах клеток гидрокортизона.

На материалах из природных очагов показана перспективность использования гидрокортизона для первичной изоляции слабовирулентных штаммов R. sibirica на морских свинках (штаммы «9/89-Сузун», «81/88-Алтай» и др.). Результаты проведенных исследований свидетельствуют о возможности использования в качестве альтернативных моделей для первичной изоляции и репродукции R. sibirica куриных эмбрионов с фтористым натрием и морских свинок, обработанных гидрокортизоном.

Полученные данные позволяют считать метод культуры клеток на покровном стекле перспективным для первичной изоляции риккетсий группы КПЛ из отдельных экземпляров переносчиков. Метод микрокультуры клеток в пластиковых панелях менее пригоден для этой цели, но удобен для изучения влияния различных химических факторов (антибиотики, стимуляторы репродукции и др.). Полученные результаты свидетельствуют также о перспективности исследований по повышению чувствительности методов первичной изоляции и репродукции риккетсий с помощью биостимуляторов.