Конструирование и сравнительное испытание иммуноферментных коньюгатов

Основные направления эпидемиологического надзора за риккетсиозами
Конструирование и сравнительное испытание иммуноферментных коньюгатов
Результаты сопоставления методов мониторинга риккетсий группы клещевых пятнистых лихорадок
Разработка приемов повышения чувствительности методов выделения риккетсий
Использование методов микроанализа для идентификации штаммов риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки
Заключение

Основным объектом для получения иммунного сырья были выбраны кролики. Сырье от них для конструирования ИФА-конъюгатов получали по разработанной схеме в изогенной системе с использованием адъюванта без микробных компонентов на основе гидроокиси алюминия (два цикла иммунизации, взятой крови - на 15-17-й день после второго цикла). Для иммунизации морских свинок и мышей линии СВА применяли тестикулы морских свинок. Отработаны различные схемы иммунизации мышей линии СВА. Оптимальной оказалась двукратная иммунизации с недельным интервалом (одна - внутримышечная, одна - внутририбрюшинная). Для иммунизации кроликов применяли тестикулярные кроличьи культуры R. sibirica (преимущественно авторские штаммы «105/87-Баево» и «107/87-Баево», депонированные в Национальном музее риккетсиальных культур при НИИЭМ им. Гамалеи РАМН), и Kakari («Тогер»). Тестикулярные культуры получали путем интратестикулярного заражения кроликов овокультурами риккетсий, подвергали лиофилизации или хранили до иммунизации в жидком азоте. Специфичность и антительную активность иммунного сырья проверяли в РОС с антигенами R. sibirica, R. akari, R. conorii и ИФА с конъюгатами «белок А-пероксидаза». Всего получено 9 серий кроличьих сывороток и 24 серии мышиных сывороток; гипериммунные лошадиные сыворотки получены из Пермского филиала ФГУП «НПО «Микроген». Наиболее высокими титрами отличались и были использованы для конструирования ИФА-конъюгатов кроличьи и лошадиные гипериммунные сыворотки (титры 1:160-1:2560), сыворотки крови мышей и морских свинок отличались менее высокими титрами, и их использование в качестве иммунного сырья для ИФА-конъюгатов оказалось нецелесообразным.

Нами разработана модифицированная методика получения иммунного сырья к риккетсиям группы КПЛ в изогенной системе на кроликах с использованием адъювантов без микробных компонентов на основе гидроокиси алюминия. Полученное иммунное сырье использовали как основу для конструирования лабораторно-экспериментальных и экспериментально-производственных серий и соответствующей НТД на тест-систему ИФА для выявления риккетсий группы клещевой пятнистой лихорадки.

Гамма-глобулиновые фракции выделяли двукратным высаливанием сульфатом аммония при 50 %-ном насыщении с последующим диализом. Выделение иммуноглобулинов класса G проводили гельфильтрацией на колонке с сефадексом G-200. Для конъюгации отбирали пиковые фракции с активностью в РСК не менее 1:800-1:1600, которые доводили до концентрации белка 15 мг/мл. Конъюгаты IgG с пероксидазой хрена (Rz 2-2,7, НПО «Биолар», Латвия) были получены методом периодатного окисления с последующим восстановлением боргидритом натрия (Tijssen P., Kurstak Е., 1984). Очистку конъюгатов проводили высаливанием 50 %-ным раствором сульфата аммония с последующим диализом осадка.

Отработаны вакуумно-сублимационная сушка конъюгатов и IgG для сенсибилизации планшет, а также оптимальные условия постановки ИФА (С.Н. Шпынов, Н.В. Рудаков, 1989, 1991). Препараты с наполнителем (10% препарата, 50 % нормаль» ной бычьей сыворотки, 40 % фосфатно-солевого буфера) лиофилизировали на аппарате типа Долинова в режиме 48 часов. Всего таким путем получено и подвергнуто последующему изучению 19 опытных серий ИФА-конъюгатов для выявления антигенов риккетсий группы КПЛ.

Активность полученных конъюгатов зависела от качества используемой пероксидазы и антительной активности сывороток Рабочие разведения конъюгатов, полученных на основе кроли его сырья, составляли от 1:200 до 1:2000, лошадиных - от 1:5 до 1:2500. В результате сравнительного испытания установлено, что как чувствительность, так и специфичность тест-систем ИФА в наибольшей степени зависела от видовой принадлежности иммуноглобулинов «подложки» и конъюгата. Оптимальные результаты получены при сочетании кроличьей «подложки» лошадиного конъюгата.